Экстракция экдистерона из левзеи
в водные и спиртовые растворы

Объект. В исследованиях использовались растения левзеи Rhaponticum carthamoides (Leuzea, maral root, rapontik, рапонтикум сафлоровидный, маралий корень), возделываемые в условиях агропопуляций Европейского Севера (Россия, Архангельская область). Географические координаты – 61°20' с.ш., 47?00' в.д. Территория относится к подзоне средней тайги и входит в состав Европейско-Сибирской таежно-лесной биоклиматической области. Район характеризуется умеренно-прохладным вегетационным периодом. Почвы дерново-подзолистые, средней окультуренности, супесчаные по механическому составу. На объектах в течение последних 5 лет минеральные и органические удобрения не применялись

Исследованиями были охвачены растения среднего генеративного возраста (8-11 года жизни). Выборочная заготовка элементов растительного сырья осуществлялась во время основных фаз развития, в течение вегетационного периода 2005 года: с мая по июль – для надземных частей; в октябре 2004 года – для подземных. В структуре биомассы надземной части выделяли морфологически разнородные органы: побеги отрастания, листья розеточные, листья стеблевые, стебель (цветонос), соцветия, семена; в подземной сфере различали корневище, главный корень, придаточные корни.

Растительный материал, сгруппированный по элементам биомассы, сушили при температуре 23-25 °С, относительной влажности воздуха 25-40%. Сушку проводили в тени, слоем 2-3 см на стеллажах с ячеистой сетью, располагающихся на высоте 40-60 см от уровня пола. Материал высушивали в цельном виде, за исключением наиболее толстых черешков и цветоносных стеблей, которые расщепляли на 2-3 части. Остаточная влажность воздушно-сухого сырья, определенная методом ускоренной сушки при 130 °С, составляла 10-13%.

Химанализы экдистероидов. Биохимические анализы растительных образцов на содержание экдистероидов выполнены в лаборатории Ботанического сада Института биологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар). Образцы для определения 20-гидроксиэкдизона (экдистерона) в лекарственном сырье формировали из воздушно-сухого сырья методом квартования. До анализа образцы хранили при комнатной температуре в полиэтиленовых пакетах.

Концентрацию экдистероидов (в т.ч. экдистерона) в различных органах и элементах биомассы растений определялась методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), с компьютерной обработкой данных по методу внутреннего стандарта [19]. Оборудование и режимы их работы: жидкостной микроколоночный хроматограф “Милихром-5-3”, колонка 80х2 мм, сорбент Nucleosil C18, с размером частиц 5 мкм (ООО “Медикант”, г. Орел, Россия); элюент вода-этанол-бутанол 75:24.2:0.8. Скорость элюирования 100 мкл/мин. Детектор УФ, длина волны 242 нм. В работе приводятся средние значения двух биологических и трех аналитических повторностей. Концентрация фитоэкдистероидов в работе приведено в пересчете на абсолютно-сухое вещество.

Определение антиокислительной емкости. Исходные образцы измельчали до частиц 1-3 мм. Экстракты получали методом настаивания на дистиллированной воде, в соотношении 1:10 по сухой массе, с последующим кипячением на водяной бане в течение 15 мин и охлаждением в течение 45 мин.

Для электрогенерации брома и кулонометрического титрования использовали кулонометр "Эксперт-006" ООО "Эконикс-Эксперт" (г. Москва). В электрохимическую ячейку объемом 50 мл вводили 25 мл фонового раствора, куда помещали рабочий, вспомогательный и индикаторные электроды. В ячейку вводили аликвоту (0.1 мл) определяемого экстракта и перемешивали в течение 100 секунд. Кулонометрическое титрование проводили в гальваностатическом режиме. Бром генерировали из водных 0.2 М растворов KBr на фоне 0.1 М H₂SO₄.

В качестве генераторного и вспомогательного использовали стеклоуглеродные электроды. Катодная камера, где помещался вспомогательный электрод, была отделена от аналита полупроницаемой перегородкой. Конечную точку кулонометрического титрования определяли амперометрически с двумя поляризованными игольчатыми платиновыми электродами (Е=300 мВ). Уровень измерения 100 мВ, ток измерения 52.10 мА.

Расчитывали количество электричества в кулонах, затрачиваемое на 100 г абсолютно сухого экстракта, по формуле: Q_Кл = 100 (I x t)/V_ал; где I – сила тока (0.0521 А); t – время достижения конечной точки титрования (сек); V_ал – объем аликвоты (0.1 мл). Влажность образцов определяли на влагомере МХ-50 A&D Company, Limited при 120 ^oС, содержание сухих веществ в экстрактах при 180 ^oС, величина навески составляла 1-5 г. Полученные результаты подвергались статистической обработке. При оценке результатов использовали значения среднего арифметического и относительного стандартного отклонения Sr.

По сведениям из литературы, левзеи Rhaponticum carthamoides (Leuzea, maral root, rapontik, левзея, рапонтикум сафлоровидный, маралий корень) обладает высокой антирадикальной активностью. Среди 215 растений Каунасского Ботанического сада, принадлежащих 163 родам и 60 семействам, отобрано 12 лекарственных и ароматических растений [12], среди которых наиболее активными были виды шалфея (Salvia officinalis, S. glutinosa), лапчатка (Potentilla fruticosa), левзея (Rhaponticum carthamoides).

В модельной антиоксидантной системе по инактивированию свободного 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилового радикала (ДФПГ-метод) [15] активность метанольных экстрактов этих видов растений в наибольшей степени коррелировала с суммой фенольных соединений (рис. 2). Для лапчатка (Potentilla fruticosa) и шалфея (Salvia officinalis) 93.9% и 92.3% активность наблюдалась при концентрации суммы фенолов в экстракте 37.9 мг/г и 22.6 мг/г.

Для левзеи (Rhaponticum carthamoides) сопоставимая активность (87.6%) проявлялась при в 2-3 раза меньшей их концентрации – 13.3 мг/г. В дальнейшем, при детальном исследовании, среди веществ антирадикальной активности левзеи (Rhaponticum carthamoides) были идентифицированы флавоноиды, фенольные кислоты, а также экдистероиды [22].

Экстрагируемость экдистерона в водные и спиртовые растворы
Перед тем, как приступить к изучению значимости экдистероидов в проявлении антирадикальной активности левзеи Rhaponticum carthamoides (Leuzea, maral root, rapontik, левзея, рапонтикум сафлоровидный, маралий корень), нами в лабораторных условиях изучена экстрагируемость фитоэкдистероидов из растительного сырья этанольными и водными растворами, а также их устойчивость к нагреванию в диапазоне температур от 20 до 100 °С.

Установлено, что фитоэкдистероиды левзеи (Rhaponticum carthamoides) извлекаются в водный раствор на уровне этанольных растворов (соответственно 0.44 и 0.45% в расчете на сухое вещество образца), а также обладают температурной устойчивостью при нагревании (рис. 3).

Рис. 2. Антиоксидантная активность: 1 – R. carthamoides; 2 – P. fructosa; 3 – S. officinalis; по Miliauskas, 2004 (с изменениями)

Рис. 3. Извлекаемость экдистероидов из надземной фитомассы левзеи R. carthamoides при различных режимах экстракции