Методы изучения накопления
экдистерона в левзее сафлоровидной

Продолжение статьи
Объекты. Исследования выполняли на юго-востоке Архангельской области, в подзоне средней тайги (62° с.ш.) в 1989-2006 годах на двух разновозрастных (12 и 17 лет) агропопуляциях левзеи сафлоровидной - Rhaponticum carthamoides (площадь соответственно 1 и 3 га, единый земельный массив). Агропопуляции представлены моноэдификаторными ценозами семенного происхождения. Первая заложена в 1989 году семенами, полученного из Коми НЦ УрО РАН, вторая — в 1994 году семенами собственного происхождения. Густота всходов — 96-121, плотность с 3-го по 10-й год — 27-23, с 13-го по 17-й — 16-14 тыс. экз/га.

Предшественниками левзеи в севообороте были картофель, однолетние и зерновые культуры. Предпосевная обработка почвы под левзею включала вспашку на глубину 22-25 см, дискование и 2-кратную культивацию с одновременным боронованием. Перед посевом левзеи (Rhaponticum carthamoides)участок прикатывали. Посев подзимний с междурядьями 70 см, в середине октября, четырехрядной овощной сеялкой СОН-2.8. Норма высева семян левзеи — 2,2-2,7 кг/га при полевой всхожести 58-66 %, глубина заделки — 2-3 см. Минеральные удобрения (NPK_60-90) вносили только в первые три года после посева; далее удобрения, химические средства защиты и регуляторы роста растений не применяли.

Методы исследований. Для отбора модельных растений левзеи Rhaponticum carthamoides ежегодно в начале фазы отрастания закладывали учетные площадки. Делянки (60-80 м² каждая) размещали по двум диагоналям поля в 5-6-кратной повторности по трансектам. Изъятие образцов надземной биомассы левзеи проводили в фазы бутонизации и цветения (I и III декада июня), массовое отчуждение (силосная масса) — начиная с 4-го года однократно после фазы плодоношения (III декада июля — I декада августа), выкопку корневищ левзеи — осенью, после завершения вегетации (октябрь).

Рельеф местности слабоволнистый повышенный, почвы супесчаные, дерново-среднеподзолистые, сформированы на двучленных отложениях. Верхний горизонт (0-28 см) - представлен частицами песка, с глубины 70-85 см преобладает среднесуглинистая фракция.

По комплексу агрохимических показателей почва участка относится к высокоокультуренным минеральным (почвенные пробы исследовали общепринятыми методами в ФГУ «Агрохимцентр Кировский», г. Киров). Содержание гумуса в пахотном слое 3,6; органического вещества — 3,1 %. Кислотность корнеобитаемого слоя оптимальная (pH_KCl обменная 6,4-6,5; pH гидролитическая 0,7 мг-экв); насыщенность основаниями высокая (12,4 мг-экв, или 93,5 %). По элементам питания обеспеченность фосфором высокая (P₂0₅ подвижный — 31,2 мг/100 г почвы); калием средняя (K₂O подвижный — 9,6 мг/100 г); содержание Ca — 6,4, Mg — 1,0 мг-экв/100 г.

Особенности климата, средняя температура воздуха и почвы описаны в литературе (12, 13). Продолжительность светлого времени суток в начале отрастания левзеи сафлоровидной Rhaponticum carthamoides (I декада мая) — 16-17 ч, во время цветения (во II-III декаде июня) — 20 ч.

Влажность почвы определяли в корнеобитаемом слое популяций левзеи сафлоровидной - Rhaponticum carthamoides в течение четырех вегетационных периодов (2000-2003 годы). Образцы отбирали по диагонали исследуемого участка в 6-10 точках на глубину пахотного слоя 22-25 см, формировали среднюю пробу, в течение 7-10 сут доводили до воздушно-сухого состояния при комнатной температуре, затем досушивали при 130 °С в течение 30 мин для удаления гигроскопической влаги.

Изучение онтогенеза растений левзеи сафлоровидной - Rhaponticum carthamoides и его периодизацию проводили по Т.А. Работнову (14) и Л.Б. Заугольновой с соавторами (15). Возрастные состояния учитывали по доминирующей группе особей. Выделяли виргинильный (прегенеративный), генеративный и сенильный (постгенеративный) периоды онтогенеза. В виргинильный период выделяли следующие возрастные состояния: проростки (p), ювенильные (j), имматурные (im) и взрослые вегетативные растения (v); в генеративном — молодые (g1), средневозрастные (g2) и старые генеративные растения (g3); в сенильном — субсенильное возрастное состояние (ss). Календарный (абсолютный) возраст популяций отсчитывался со времени появления всходов.

В прегенеративный период индикаторными признаками возрастных состояний левзеи служили: для ювенильного — формирование зародышевого розеточного побега со стеблекорнем, для имматурного — кущение вегетативных побегов и формирование корневища, для виргинильного — развитие системы вегетативных побегов, отсутствие плодоношения.

Критерии молодого генеративного состояния: формирование репродуктивных побегов, слабое плодоношение, отсутствие признаков отмирания корневища; взрослого — относительный максимум числа репродуктивных побегов, высокая интенсивность роста и плодоношения, уравновешенность процессов новообразования и отмирания; старого — резкое снижение доли репродуктивных побегов, ослабленный рост, неполноценность и периодичность плодоношения, преобладание процессов отмирания корневища.

В постгенеративный период субсенильное возрастное состояние различали по отсутствию генеративных побегов у большинства особей, резкому снижению качества плодоношения и числа почек возобновления, а также партикуляции корневища (распаду материнской особи на дочерние).

Фенологические наблюдения проводили в соответствии с «Методическими указаниями» (16). Отмечали даты наступления и завершения следующих фаз: в цикле вегетативных (розеточных) побегов — отрастания, вегетации, отмирания и покоя; в цикле репродуктивных (генеративных) побегов — начала отрастания, бутонизации, начала цветения, массового цветения, плодоношения, отмирания. Периодичность наблюдений составляла: до фазы бутонизации — 3-4 раза, цветения и плодоношения — 2 раза в неделю.

Оценку динамики среднесуточного роста побегов левзеи выполняли с интервалом 5-6 сут на 15-20 типичных, случайно выбранных на каждую дату особях. Динамику роста учитывали, исходя из высоты наиболее развитых побегов растения, от уровня почвы до верхушки побега в выпрямленном виде. Ширину листовой пластинки измеряли в самом широком месте, распрямив лист. В развитии побегов отмечали развертывание, взросление, старение и отмирание листовых органов, исходя из характера листосложения, активности функционирования и степени разрушенности листовой пластинки.

Для определения биологического возраста левзеи сафлоровидной Rhaponticum carthamoides в онтогенезе и величины фитомассы в агропопуляции на 1-2-м году жизни с учетных площадок отбирали 18-20 случайно выбранных особей с корневой системой, на 3-4-й год — 8-10; на 6-9-й — 6; на 10-13-й — 5; на 14-17-й — 4. Продуктивность рассчитывали на основе первичного анализа морфологической структуры надземных и подземных органов.

Для изучения содержания экдистероидов в левзее (экдистерона, инокостерона и экдизона) в различных органах растений, элементах и фракциях фитомассы на 6-8-м году жизни (взрослое генеративное состояние) из агроценоза отбирали по 6-10 типичных особей, надземную часть которых срезали на уровне почвы.

В надземной фитомассе левзеи сафлоровидной Rhaponticum carthamoides выделяли морфологически разнородные органы (17) — укороченные вегетативные (розеточные) и стеблевые генеративные (репродуктивные) побеги; среди розеточных и стеблевых листьев различали разновозрастные фракции (18). В каждой выборке исследовали 275-300 вегетативных побегов, содержащих 1100-1500 розеточных листьев, и 30-35 генеративных побегов со 750-1000 стеблевых листьев.

Листовые органы левзеи относили к отдельным фракциям, исходя из физиологического возраста и состояния (размеры, опушенность, окраска, цельность листовой пластинки). В составе генеративных побегов левзеи идентифицировали: стебли, стеблевые листья разного физиологического возраста (верхние молодые, средние взрослые и нижние старые) и соцветие, вегетативных — фракции молодых, взрослых и старых листьев. У стеблей дополнительно выделяли апикальную (прицветную), верхнюю, среднюю и нижнюю (базипетальную) часть; у соцветий — цветоложе и семена.

Растительный материал (органы, элементы и фракции) сушили при переменной температуре от 23-25 до 35-40 °С и относительной влажности воздуха 25-40 % в соответствии с правилами по заготовке и сушке лекарственного сырья (19). Остаточная влажность воздушно-сухого сырья, определенная методом ускоренной сушки при 130 °С (20), составляла 10-12 %. Образцы из воздушно-сухого сырья для определения концентрации экдистероидов формировали методом квартования. До анализа их хранили в полиэтиленовых пакетах при комнатной температуре 3-5 мес.

Изменчивость содержания экдистероидов (экдистерона, инокостерона и экдизона) в различных элементах лекарственного сырья левзеи отслеживали в фазы бутонизации и цветения, в онтогенезе агропопуляции — по возрастным периодам и состояниям, в сезонном цикле развития — с момента весеннего отрастания и до фазы покоя осенью. Объектами служили элементы — концентраторы экдистероидов: листовые пластинки вегетативных побегов и апикальные части генеративных побегов, представленные цветоложем и семенами. Образцы вегетативных побегов отбирали в разные фазы развития от 20-25 растений левзеи (по 2 розеточных листа, генеративных (семена) — во время фазы плодоношения (от урожая соцветий массового сбора).

Содержание экдистероидов (экдистерона, инокостерона и экдизона) в сухих образцах левзеи сафлоровидной - Rhaponticum carthamoides определяли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), с компьютерной обработкой данных по методу внутреннего стандарта (21) (анализы выполнены в лаборатории биохимии и биотехнологии растений (1992-2000 годы) и биохимической лаборатории Ботанического сада (2001-2006 годы) Института биологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар).

Использовали жидкостный микроколоночный хроматограф «Милихром-5-3» (колонка 80х2 мм, сорбент Nucleosil C18 с размером частиц 5 мкм) (ООО «Медикант», Россия); элюент — смесь вода-этанол-бутанол 75:24,2:0,8, скорость элюции — 100 мкл/мин, УФ-детектор (242 нм). Учитывали средние значения двух биологических и трех аналитических повторностей (в процентах от воздушно-сухого вещества).

Математическую обработку показателей проводили стандартными методами вариационной и корреляционной статистики, с использованием модуля Statistica компьютерной программы Excel 2003. Использовали параметры генеральной (по результатам сплошного учета) и выборочной совокупности. Для исключения систематических погрешностей с краевых участков агроценоза образцы не отбирали, поверхностные слои отбираемых проб не анализировали; данные по единичным экземплярам, по виду отличающимся от нормальных, при обработке не учитывали; к остаточному материалу и типичным особям применяли метод случайной выборки.

Продолжение следует. Следите на странице "Новости"